ヘビ類は水田生態系における高次捕食者であり、水田生態系の現状を調査するのに欠かせない分類群である。ヘビ類の調査では目視や捕獲が中心で、種の識別には専門知識が必要であること、調査時に遭遇する機会が少なく、詳細な分布情報を把握しづらいことが課題となっている。そこで、広範囲を比較的容易に調査可能である環境DNA分析を用いて水田生態系に生息するヘビ類の検出系の確立を試みた。まず、シマヘビ、ヤマカガシ、ニホンマムシを対象にそれぞれ種特異的なプライマーとプローブをミトコンドリアCytB遺伝子に設計した。それぞれの検出系の種特異性と飼育環境からの対象種DNAの検出を確認した上で、野外環境サンプルに適用した。兵庫県南東部の圃場整備をしていない水田（伝統地）8区域、圃場整備をおこなった水田（整備地）8区域、耕作放棄された水田（放棄地）2区域において、水田、ため池、用水路より採水した夏季87サンプル、秋季51サンプルを用いて3種の検出を試みた結果、ヤマカガシとニホンマムシのDNAを検出する事に成功した。ヘビ類の環境DNAが検出された区域はすべて伝統地であり、標高の高く、周囲の森林面積の大きい区域であった。このことから、ヘビ類の生息密度は管理形態や標高および周囲の森林面積と関わりが深いことが示唆された。これらの結果は環境DNA分析が水田生態系に生息するヘビ類のモニタリングに有効であることを示した。